聚氨酯（polyurethane, PU）作为全球重要的高分子材料，2024年全球消费量达到2200万吨，构成了第二大类别的可水解塑料。然而，商业聚氨酯通常为高度交联的热固性材料，其骨架由化学性质稳定的氨基甲酸酯键构成，难以在温和条件下实现高效解聚。目前，醇解是聚氨酯最有前途的工业规模化学回收方法。该工艺可使聚酯的多元醇段与二乙二醇（diethylene glycol, DEG）等醇类试剂发生酯交换反应，生成富含多元醇的上层相，可回收用于新的聚氨酯合成。然而，反应体系中还会形成超过60%（w/w）的底层相，其中积累了过量的DEG与多种N-芳基氨基甲酸酯，如甲苯二胺-DEG（toluenediamine-DEG, TDA-DEG）。这些物质难以被进一步利用，被作为危险废物焚烧，造成环境和经济负担。因此，推动它们的高效生物降解，成为聚氨酯回收过程的关键。尽管早期的工作中提出了利用脲酶来开展聚氨酯的解聚，但已报道的脲酶仍面临着在有机溶剂兼容性方面的挑战。因此，开发能够在高浓度醇解体系下保持高效催化的脲酶，是实现聚氨酯工业规模下生物酶解的重要前提。
在本研究中，作者提出了一个基于深度学习的酶挖掘框架GRASE（graph neural network–based recommendation of active and stable enzymes），用于同时评估候选酶的底物口袋结构特征与序列稳定性（图1B）。该框架结合了Pythia-Pocket（用于催化口袋表示）和Pythia（用于序列结构稳定性预测），能够从数据库中筛选出同时具有功能相似性与结构稳定性的潜在脲酶候选体（图1A, B）。相较于传统基于序列或结构的方法，GRASE能够捕捉到催化位点的局部结构特征，从而有效挖掘与模板酶Aes72在催化功能上高度相似的远缘相关酶。
作者对文献与数据库候选酶进行测试，只有极少数表现出脲酶活性。相比之下，GRASE共筛选出24条候选序列，其中21条成功表达并表现出对N-芳基氨基甲酸酯的脲酶活性，17条能产生TDA单体，且8条催化性能优于Aes72。其中来源于脂环酸芽孢杆菌属（Alicyclobacillus sp.）的候选酶AbPURase（GB6），在所有筛选酶中表现最为突出，展现出显著的有机溶剂耐受性与结构稳定性（图1C, D）。它对2,4-TDA-DEG的活性提高了32倍（2.14 U/mg），对2,6-TDA-DEG的活性提高了62倍（0.94 U/mg）。并且，在6 M DEG的模拟醇解条件下，AbPURase的活性更加显著，在50 ℃和37 ℃下分别比Aes72提高了465倍和170倍。
图1 GRASE鉴定酶的模型构建及功能验证
为了进一步验证AbPURase的工业应用潜力，作者对来自BASF的1 kg商业聚氨酯泡沫进行了化学-酶法降解实验（图2A）。醇解得到的底层相由83%的8.6 M DEG和14%的芳香族化合物组成，AbPURase能够在50 ℃、8 mg/g的酶负载量下于12 h内完成98 %的底物完全转化（图2B, C）。得到的TDA单体通过精馏被有效回收，TDA和DEG的回收率分别达到94.7%和98.5%。此外，AbPURase还表现出显著的可重复使用性，无需固定化处理可循环至少三轮，且仍维持近乎完全转化的水平。
图2 BASF聚氨酯泡沫的化学-酶法解聚
为了研究脲酶功能的分子起源，作者进行了比较结构分析。GRASE与其他方法获得的候选酶展现出高度一致的叠加结构，RSMD值<1 Å，表明基于整体结构的筛选难以识别出功能上的细微差别。相较于全局结构检索的非功能蛋白质，AbPURase的催化口袋具有开放的V形结构，可能为进行底物结合和高效催化提供充足的空间（图3B）。此外，详细的结构分析表明，AbPURase中M38与多个盖结构域残基相互作用形成了紧密的疏水核心，且其中的loopα1-α2富含P24、P25、P27等脯氨酸残基，可能有助于在高浓度DEG中维持结构的稳定。AbPURase同时表现出酯酶和酰胺酶活性，通过动力学分析，作者进一步验证了其对氨基甲酸酯的高性能可能主要来自于其强大的酰胺酶活性（图3C）。
图3 酶之间的结构比较和动力学参数
本研究基于深度学习模型构建的GRASE框架，有效突破了传统序列筛选的限制，成功从大规模序列空间中挖掘出新型脲酶AbPURase。该酶能够直接兼容醇解体系，在高浓度的DEG条件下仍保持高活性和高稳定性，实现了对N-芳基氨基甲酸酯的快速水解与TDA单体的高效回收。这一结果为开发兼具活性与稳定性的工业级酶提供了新的方法，也为聚氨酯材料的高效回收利用奠定了基础。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.adw4487
