文献分享丨JACS：基于纳米孔的蛋白质鉴定

如何识别复杂混合生物样品中不同类别蛋白质仍然是当前细胞生物学和临床医学的一个重大挑战，建立一种简单、高效、快速和低成本的全蛋白质组测量技术将成为医疗检测的有力工具。然而，目前主流的蛋白质组学分析技术如质谱、二维电泳等对待测蛋白质的浓度具有一定要求，而目前缺乏高通量的方法产生足够浓度的单一蛋白质，使其无法完全满足蛋白质组的精准分析。当前，单分子蛋白质组学分析技术的发展突破了低浓度蛋白质检测的限制，其中纳米孔测试技术以其操作简单、高灵敏度、高分辨率和无标签检测等优点而发展为一种有力的检测技术。这篇文献基于纳米孔技术建立了一种单分子尺度的蛋白质指纹图谱并用于蛋白质的鉴定。待测蛋白质被裂解成多肽片段后通过纳米孔时产生不同的电信号，将电信号结果与已知蛋白的信号数据库进行比对，便可确定待测蛋白的类别。

单分子纳米孔技术是在纳米孔两端施加定向电流（I_o），当蛋白质经胰蛋白酶水解后生成的不同多肽片段在电渗流的推动下进入纳米孔腔内（图1A），将产生不同的阻断电流（I_b）和保留时间（t_b）（图1B），通过监测纳米孔电流的变化即可计算阻断电流与开放电流之比（I_b/I_o），结合保留时间（t_b）可实现多肽片段的鉴定。这篇文献中作者采用Aerolysin（以下简称AeL）纳米孔在单分子水平上对肌红蛋白（16.9 kg mol⁻¹）、溶菌酶（14 kg mol⁻¹）和细胞色素c （12 kg mol⁻¹）三个蛋白裂解后的多肽进行识别，结果表明AeL能够有效的识别具有相似分子质量的多肽。

图1.（A）基于纳米孔的单分子指纹分析方法原理。（B）AeL纳米孔中单一蛋白质片段所引起的典型电流阻断。（C）不同蛋白质片段的电流阻断信号。

作者首先将折叠的目标蛋白展开，用胰蛋白酶水解形成若干多肽片段。这些片段很容易被AeL纳米孔捕获并在孔腔内停留较长时间，由此不同的蛋白质片段就产生了不同的电流阻断信号（图1C），记录阻断持续时间t_b和阻断电流比I_b/I_o并绘制成t_b-I_b/I_o散点图（图2A）和I_b/I_o直方图（图2B），目标蛋白的识别信息由多肽片段群的数量及相应的I_b/I_o决定。

图2.（A）t_b-I_b/I_o散点图，其中每个点对应单一的电流阻断。（B）I_b/I_o直方图，其中不同颜色对应不同的多肽片段群。

为了评估AeL纳米孔区分不同目标蛋白的能力，作者分析了三种相对分子质量相似的目标蛋白：肌红蛋白（16.9 kg mol⁻¹）、溶菌酶（14 kg mol⁻¹）和细胞色素c（12 kg mol⁻¹），它们均被胰蛋白酶分解成大小不同的多肽片段。结果表明，三个目标蛋白对应的t_b-I_b/I_o散点图和I_b/I_o直方图存在显著区别，不同目标蛋白的水解产生的多肽片段群体数目及相应的I_b/I_o值、每一条多肽片段I_b/I_o所对应的t_b以及每一个I_b/I_o值的集合数量均不相同（图3A-D），且每一个目标蛋白的多肽片段群体的数量和I_b/I_o值实验可重复性高（以下仅展示肌红蛋白的实验结果）（图3E），证明AeL纳米孔具有区分不同目标蛋白的能力。

图3.（A-C）肌红蛋白（绿）、溶菌酶（红）和细胞色素c（蓝）的t_b-I_b/I_o散点图（上）和I_b/I_o直方图（下）（D）比较三种不同目标蛋白的<I_b/I_o>值。（E）肌红蛋白三次重复实验的I_b/I_o直方图。（F）比较肌红蛋白三次重复实验的<I_b/I_o>值。

由于人类蛋白质组中不同蛋白质的估计数量庞大（＞2×10⁴），仅以多肽片段群体数量和相应的I_b/I_o值（图4A）作为鉴定参数可能会发生不同种蛋白质的重叠，故作者进一步考虑了每个目标蛋白在相应I_b/I_o值下的阻断电流标准差（σ_b）（图4B）、某一I_b/I_o片段群的阻断持续时间（t_b）分布（图4C,E）和阻断电流标准差分布（图4D,F）作为额外的阻断特性，以进一步完善不同目标蛋白的指纹信号。

图4.（A-B）肌红蛋白的t_b-I_b/I_o散点图和阻断电流标准差σ_b-I_b/I_o散点图。（C-D）每个片段群的平均<t_b>平均<I_b/I_o>的散点图和平均阻断电流标准差<σ_b>-平均<I_b/I_o>的散点图，误差棒的长度对应最低和最高的差值。（E-F）给定I_b/I_o群体中的ln(t_b)和σ_b值的典型分布。

最后，作者比较了纳米孔检测获得的多肽片段数据与理论上胰蛋白酶分解产生的肽片段信息（图5A-C）。结果表明，理论上胰蛋白酶分解获得的肌红蛋白、溶菌酶和细胞色素c肽片段的数量分别为23、24、23个，而AeL纳米孔检测获得的肽片段数量分别为8、9、9个，少于理论的片段值，这与纳米孔对多肽片段的阻断程度和相对阻断时间有关。尽管没有检测到所有的片段类型，AeL纳米孔仍能够分辨相似分子质量的目标蛋白。

图5.（A-C）胰蛋白酶分解的肌红蛋白（A）、溶菌酶（B）和细胞色素c（C）产生的理论片段的数量分类图。红、灰、蓝分别代表带正电、中性、带负电的片段；左列为所有的肽片段，右列为超过三个氨基酸的肽片段。

这篇文献证明了AeL纳米孔能够捕获胰蛋白酶分解产生多肽片段群体所产生的信号，并以此区分不同的目标蛋白。该方法的优点是容易操作、快速、低成本，且无需对蛋白质进行标记。通过特定的I_b/I_o值、相对阻断时间和阻断时间的标准差分布等信息可以有效分辨相似分子质量的目标蛋白。与其他的指纹识别技术一样，该方法需要建立大型数据库，通过比对分析鉴定目标蛋白。

同时，作者还表明，除上述表征值以外，通过改变实验条件如电压极性、电解液浓度、pH值、温度等将可能提供额外的用于识别目标蛋白的特征性参数。该技术有望整合到高通量纳米孔测试平台，并为细胞生物学和临床医学提供一种高效可靠的蛋白质鉴定技术。

编    辑： 苑子恒 夏钟升

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