生物传感小组
Nature communication：基于DNA纳米器件的单分子生物传感器构建
前言导论
随着人们对疾病早期诊断需求的不断提升，建立一种快速且低成本的疾病生物标记物的检测方法越来越重要。众所周知，生物体内的相关免疫因子或肿瘤标记物等通常以非常低的浓度存在，如何从一个含有多种成分的临床样本里面检测到目标生物标记物是一个巨大的挑战。目前采用的临床诊断检测一般基于平均免疫检测如酶联免疫吸附检测(ELISAs)，即在这些实验中，通过抗原抗体的相互作用收集群体响应信号，无法体现个体的免疫响应特征，因此建立一种单分子生物标记物检测方法不仅有望在临床样本中检测到更低浓度的标记物，而且能够深入的研究个体在免疫反应中所起的作用。
作者对比了各种单分子检测技术及其存在的优劣势，将纳米孔检测技术和DNA折纸术相结合，建立一种单分子生物传感器用于检测人C反应蛋白（CPR），通过分析易位离子电流形成的电流峰特征、峰振幅（peak amplitude）和停留时间（dwell time）对CPR蛋白进行定性分析，并将该技术应用于临床样品即人血浆稀释液中CPR的定量分析，成功构建用于临床生物标记物检测的单分子生物传感器。
研究内容及方法
一般生物小分子体积都明显小于纳米孔的孔径（如图1），从而导致通过纳米孔的时间过快且只能检测到微弱的信号变化，难以和基线噪声分离。因此作者借助DNA折纸术设计了三种方形的DNA器件（如图2a），分别为ConA（实心，100*85 nm），ConB（空心，空心长宽30*12 nm），ConC（空心，空心长宽650*35 nm），通过AFM成像图可知三种结构构建成功（如图2b）。然后作者进一步用纳米孔检测这三种纳米器件的易位离子电流，由图2c可知，当纳米器件存在中空的情况下，电流信号会从单峰变成双峰，并且实心的ConA通过纳米孔时产生的振幅(121 ± 23 pA) 和停留时间 (0.15 ±0.01 ms)都明显有别于空心的ConB (停留时间 = 0.22 ± 0.06 ms 和振幅= 97 ± 13 pA)和ConC (停留时间= 0.31 ± 0.14 ms和振幅= 86 ± 19 pA)，同时双峰的信号特征会随着DNA纳米器件的结构变化而发生变化。
图1：孔径约100 nm的玻璃纳米管口的成像图
图2：a）同心方形DNA折纸纳米结构示意图，b）AFM显微镜下三种DNA折纸器件成像图，c）三种器件对应的易位离子电流特征。
基于DNA纳米器件构建的成功，作者随后展开生物标记物的检测，人C反应蛋白是反应人体内炎症程度的表征因子，因此作者将其作为目标检测物。通过文献调研选择两种DNA适配体用于捕获样品中的CRP，实验发现适配体1的动力学速率要高于适配体2，于是选择DNA适配体1继续进行下一步研究。通过DNA序列设计在DNA折纸纳米器件空腔的位置插入DNA适配体1（如图3b），并加入CRP蛋白进行孵育和检测。结果如图3c-d所示，不同于空载的DNA器件的峰振幅（65 pA）和停留时间（0.3 ms），结合了CRP的DNA器件会出现一个小的电流峰，其峰振幅和停留时间分别为100 pA和0.15 ms，说明该方法能够成功的应用于CRP分子的检测。
图3：a）以DNA纳米结构为基础的生物传感器检测示意图，通过纳米管的易位电流作为传感机制，b）结合CRP和未结合CRP的纳米器件AFM成像示意图，c）DNA纳米器件（9 nM）和CRP蛋白（9 nM）孵育后检测的振幅和停留时间，d）CRP、CRP- DNA适配体复合物、未占据载体和CRP结合的已占据载体的典型离子电流特征。
最后作者尝试将该方法应用于临床样本如人血浆稀释液中CRP分子的检测，首先作者选择未添加CRP分子的血浆稀释液作为对照，结果如图4a所示，电流出现双峰且停留时间(0.26 ms)和电流峰振幅(55 pA)与图3C测试结果相似；然后作者将DNA纳米器件与含不同浓度CRP分子（3 nM、9 nM和36 nM）的血浆稀释液孵育一段时间后，通过纳米孔检测可知，随着CRP分子浓度的增加，结合CRP的DNA纳米器件停留时间逐渐缩短（从0.25 ms到0.12 ms），电流峰振幅逐渐增大（从56 pA到98 pA）（如图4b）；同时通过统计发现随着CRP分子浓度增加易位离子电流峰中出现单峰的次数也随之增加（如图4c）；可见该器件能够实现临床样品中CRP分子的定量检测。
图4：a）未结合CRP分子的DNA纳米器件易位离子电流特征、振幅和停留时间变化，b）结合人血浆稀释液中不同浓度CPR分子的DNA纳米器件易位离子电流特征、振幅和停留时间变化，c）随CRP分子浓度增加，电流峰中单峰信号出现概率的相关性曲线。
总结
该工作成功构建了一种基于单分子生物标记物检测的纳米孔检测技术，不同于平均信号的检测方式，该方法能够分析个体结合标记物后产生的信号变化。在构建过程中发现不同的DNA纳米器件结构会引起电流峰出现单峰和双峰的曲线，分析出现这种现象的原因及如何进行调控。该生物传感器实现了在3 nM检测限下测定临床样本中人C反应蛋白的浓度。这种方法未来有望能够应用于多种生物标记物的临床检测。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-18132-1
撰稿人：庄小燕（2017级博士）
校稿人：张瑷珲（博士后）
